從秀麗隱桿線蟲 (302 個神經(jīng)元) 到果蠅 (約 10 萬個神經(jīng)元)，截止到今天，已經(jīng)有許多項目繪制了各種生物的全腦連接組圖譜。而黑腹果蠅是被人類研究得最徹底的生物之一，截至 2017 年，已有 8 個諾貝爾獎頒發(fā)給使用果蠅的研究。

研究者對果蠅的研究還在繼續(xù)，近日，來自普林斯頓大學(xué)等機構(gòu)的研究者發(fā)布了果蠅的全腦連接組，包括約 130k 個注釋神經(jīng)元和數(shù)千萬個類型突觸。

大家多少都了解，從古老的動物開始就存在基本的神經(jīng)系統(tǒng)，但大腦系統(tǒng)的出現(xiàn)要追溯到 5 億年前。研究表明將大腦劃分為不同區(qū)域有助于理解其功能。

然而，多年來，關(guān)于神經(jīng)元和突觸層面的神經(jīng)連接圖一直存在爭議，造成這一現(xiàn)象的主要原因在于人類缺乏能夠重構(gòu)此類連接圖的技術(shù)。隨著技術(shù)的發(fā)展，情況在 21 世紀(jì)初才開始發(fā)生變化。

直到今天，來自普林斯頓大學(xué)等機構(gòu)的研究者發(fā)布了果蠅的全腦連接組，這是首個完整的成年果蠅大腦神經(jīng)連接圖。

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論文地址：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.27.546656v1.full.pdf

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在該成果發(fā)布之后，有人表示：「許多項目繪制了各種生物的全腦連接組圖，從秀麗線蟲（302 個神經(jīng)元）到果蠅（約 100k 神經(jīng)元）。以我們目前的計算能力，為什么不能在一個虛擬的 3D 環(huán)境中對這些生物進行精確的計算機模擬呢？」

首個完整的成年果蠅大腦神經(jīng)連接圖

果蠅的大腦看起來很小，擁有 10^5 個神經(jīng)元和 10^8 個突觸，盡管如此，果蠅借助這些能夠完成看、聞、聽、走，當(dāng)然還能飛。

長期以來，研究者通過電子顯微鏡（EM）圖像已經(jīng)對果蠅大腦的部分區(qū)域進行了重建，這些圖像清晰度還不錯，能夠顯示出神經(jīng)元的細(xì)小分支和相連的突觸。由此得到的神經(jīng)回路的連接圖為研究者理解大腦如何產(chǎn)生社交行為、與記憶有關(guān)的行為以及導(dǎo)航行為提供了關(guān)鍵見解。

然而，EM 方法雖然已經(jīng)應(yīng)用于大腦的部分區(qū)域，并重建了信息豐富的局部連接圖，但對于更全面地理解大腦功能來說，這種方法還不足夠。

此前，研究者基于 Ito 等人的研究來構(gòu)建單個神經(jīng)突觸網(wǎng)格，本文采用的網(wǎng)格是基于此前生成完整大腦分割的 JFRC2 標(biāo)準(zhǔn)腦模板，這些網(wǎng)格也被用于 Virtual Fly Brain（模擬果蠅）項目。通過一系列非剛性變換，該研究將這些網(wǎng)格從 JFRC2 空間移動到 FlyWire（FAFB14.1）空間中。

注：FlyWire 是一個用于探索果蠅大腦的全腦連接組學(xué)平臺。自 2019 年以來，科學(xué)家和經(jīng)驗豐富的校對員一直在使用 FlyWire 來校對 AI 對整個果蠅大腦的分割。截至 2023 年 6 月，在 FlyWire 中已經(jīng)校對了超過 120,000 個神經(jīng)元，包括整個中央大腦。

如下圖所示，該研究重建的整個成年果蠅大腦包含 127,978 個神經(jīng)元（圖 1a），它們之間有 5300 萬個突觸。成年雌性果蠅的全腦圖像 (圖 1e, f) 先前通過串行切片傳輸 EM 獲得，并由 Zheng et al. 發(fā)布到公共領(lǐng)域。

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本文表明，該研究對整個果蠅大腦的重建所得到的連接圖已經(jīng)足夠完整，足以被稱為「連接組（connectome）」。與秀麗隱桿線蟲（300 個神經(jīng)元，小于 10^4 個突觸）和果蠅第一齡幼蟲（3,000 個神經(jīng)元，5×10^5 個突觸）相比，其連接組有了明顯的飛躍：連接組不僅僅是數(shù)量上超越了果蠅半個大腦，它還涵蓋了果蠅中央大腦的食道下區(qū)（SEZ），該區(qū)域?qū)ξ队X和機械感知等非常重要，此外，連接組還涵蓋了從果蠅大腦向下驅(qū)動運動神經(jīng)元的過程。

下圖為神經(jīng)元類別，圖（a）顯示將果蠅大腦中的神經(jīng)元按「流」進行分類：內(nèi)在的、傳入的、傳出的。然后每個流類根據(jù)位置和功能進一步劃分為「超類」。第一次公開發(fā)布的復(fù)眼缺失了約 8000 個視網(wǎng)膜細(xì)胞和一個半球的四個小眼珠，這些部分用陰影條表示。（b）利用這些神經(jīng)元注釋，該研究在果蠅大腦的超類之間創(chuàng)建了一個聚合的突觸圖。(c) 每個超類中所有神經(jīng)元的效果圖。(d) 除了眼神經(jīng)和頸結(jié)締組織 (CV) 外，每個半球還有 8 個神經(jīng)。所有穿過神經(jīng)的神經(jīng)元都被重建和解釋了。(e) 感覺神經(jīng)元可以根據(jù)其對感覺模態(tài)的響應(yīng)進行細(xì)分。在 FlyWire 中，幾乎所有的感覺神經(jīng)元都已經(jīng)按模態(tài)進行了分類。(f) 所有非視覺感覺神經(jīng)元的渲染圖。

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下圖為果蠅大腦負(fù)責(zé)處理視覺信息的示圖：

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下圖為信息通過果蠅的中央大腦流動：

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有史以來最大的細(xì)胞類型的驗證集合

FlyWire 連接組是迄今為止獲得的最大和最復(fù)雜的連接組。在另外一篇論文《A consensus cell type atlas from multiple connectomes reveals principles of circuit stereotypy and variation》中，團隊提出并回答了一些關(guān)鍵問題，進一步解釋了這種規(guī)模的連接組：

1）如何知道哪些 edge 是重要的？

2）如何簡化連接組圖以幫助自動或人工分析？

3）該連接組在多大程度上是一個單一的大腦的快照或代表這個物種的整體？

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論文鏈接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.27.546055v1.full.pdf

這些問題，都與數(shù)據(jù)集內(nèi)和跨數(shù)據(jù)集的連接組注釋和細(xì)胞類型鑒定有著密不可分的聯(lián)系。

在最基本的層面上，如果沒有一個全面的注釋系統(tǒng)，導(dǎo)航這個連接組將是非常具有挑戰(zhàn)性的。所以，團隊這篇論文的注釋提供了一個索引和分層的人類可讀部件列表，使生物學(xué)家們能夠探索他們感興趣的系統(tǒng)和神經(jīng)元。

連接組注釋對于確保數(shù)據(jù)質(zhì)量也是至關(guān)重要的，因為它不可避免地揭示了必須糾正的分割錯誤。此外，果蠅有豐富的歷史，探究廣泛的先天和后天行為的電路基礎(chǔ)，以及它們的發(fā)育遺傳起源；想要實現(xiàn)數(shù)據(jù)集的全部潛力，只有通過交叉識別連接組內(nèi)的細(xì)胞類型與那些先前在已發(fā)表和正在進行的文獻中的特征。

與部分半腦連接組的對比證實了，大多數(shù)蒼蠅細(xì)胞類型是高度定型的；以及，定義簡單和一般啟發(fā)式的連接組內(nèi)的連接是可靠的，也更可能是功能性的。然而，這也揭示了一些細(xì)胞類型的意外變化，并表明許多細(xì)胞類型最初在半腦中的報告不能可靠地重新識別。這一發(fā)現(xiàn)使研究者認(rèn)為有必要開發(fā)和應(yīng)用一種新的強有力的方法來定義跨連接組學(xué)數(shù)據(jù)集的細(xì)胞類型。

在這項研究中，研究者為蒼蠅大腦中的所有神經(jīng)元生成了人類可讀的不同粒度水平上（超類、細(xì)胞類、血緣類等）的注釋。

研究者提供的 4179 種細(xì)胞類型圖譜并不是有史以來最大的（半腦有 5620 種，小鼠腦中的最新工作提供了多達 5000 個分子簇）。然而，某種程度上說，它是有史以來最大的細(xì)胞類型的驗證集合。

細(xì)胞類型是一個關(guān)于動物內(nèi)部和跨動物的生物變異性的可證實的假設(shè)。在秀麗隱桿線蟲中，從最初的連接組推斷出的 118 個細(xì)胞類型已被隨后的連接組和分子數(shù)據(jù)的分析所明確支持。在一些哺乳動物中，生成 100 個細(xì)胞類型的目錄是可能的，且已被比如在視網(wǎng)膜或運動皮層的多模態(tài)數(shù)據(jù)所驗證。

然而，大規(guī)模的分子圖譜產(chǎn)生了高信息量的層次結(jié)構(gòu)，但還沒有嘗試精確地定義終端細(xì)胞類型 —— 跨個體的最細(xì)單元。研究者首次對 5000 多種細(xì)胞類型測試了這一可證偽的細(xì)胞類型假設(shè)，在 3 個半球的連接體數(shù)據(jù)中確認(rèn)或糾正了約 3166 種細(xì)胞類型。

值得注意的是，連接組數(shù)據(jù)對細(xì)胞類型的劃分特別有意義：它本身是多模態(tài)的（通過提供形態(tài)學(xué)和連接性），而且能夠看到大腦內(nèi)的所有細(xì)胞（完整性）。通過這一嚴(yán)格測試的細(xì)胞類型是非常不可能被修改的（永久性）?；谶@種理解，僅在 FlyWire 數(shù)據(jù)集的兩個半球內(nèi)定義的另外 850 個細(xì)胞類型也應(yīng)該是準(zhǔn)確和永久的。研究者認(rèn)為，連接組數(shù)據(jù)將成為細(xì)胞類型的黃金標(biāo)準(zhǔn)。因此，將分子和連接組學(xué)的細(xì)胞類型聯(lián)系起來將是關(guān)鍵。

在 FlyWire 中，超過三分之一的半腦細(xì)胞類型還不能被識別，可能人們會感到有些驚訝甚至失望。研究者重申，大多數(shù)細(xì)胞是可以被識別的，而且他們期望通過自己和其他同行的努力，在現(xiàn)在的平臺和工具上繼續(xù)逐步改進。

盡管如此，目前的結(jié)果揭示了幾個重要的問題：首先，使用單一腦半球的數(shù)據(jù)所確定的許多細(xì)胞類型現(xiàn)在需要修改；其次，新的多連接組分型方法（圖 6）為該問題提供了一個強大而有效的方法；第三，成年蒼蠅連續(xù)變異的例子通常與哺乳動物細(xì)胞類型相關(guān)，研究者現(xiàn)在也有工具和數(shù)據(jù)，能夠以此前不可能的精度來處理這種變異。

跨腦細(xì)胞分型

總體來說，這項工作奠定了某些基礎(chǔ)，既可以深入研究目前和預(yù)期中正常的蒼蠅連接組，也可助力未來的性雙態(tài)、經(jīng)驗依賴的可塑性、全腦規(guī)模發(fā)展和疾病等方向的研究。